軍團(tuán)菌（legionella）是一種常見(jiàn)的水源性致病微生物，廣泛存在于各種水環(huán)境中，特別是在包括飲用水在內(nèi)的人工水體中。目前空調(diào)冷卻水、噴泉水等非飲用水中軍團(tuán)菌污染問(wèn)題已引起各國(guó)研究者的廣泛關(guān)注，而飲用水中軍團(tuán)菌污染的相關(guān)研究較少。但近年來(lái)飲用水系統(tǒng)被軍團(tuán)菌污染事件時(shí)有發(fā)生，特別是2020年受新冠疫情的影響，多數(shù)建筑長(zhǎng)期封閉導(dǎo)致供水系統(tǒng)長(zhǎng)時(shí)間水流停滯，為軍團(tuán)菌的生長(zhǎng)繁殖提供有利條件。2020年5至7月美國(guó)有報(bào)道稱，包括美國(guó)疾控中心多處辦公樓在內(nèi)的供水系統(tǒng)、度假酒店的自來(lái)水以及大學(xué)校園的建筑供水均檢出軍團(tuán)菌。感染軍團(tuán)菌可引起嚴(yán)重的呼吸道傳染病，其中嗜肺軍團(tuán)菌（legionella pneumophila，lp)與人類(lèi)疾病關(guān)系最為密切。目前我國(guó)現(xiàn)行《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（gb 5749-2006）未對(duì)軍團(tuán)菌指標(biāo)提出控制要求，現(xiàn)有的微生物指標(biāo)也無(wú)法準(zhǔn)確提示軍團(tuán)菌污染水平。但美國(guó)環(huán)保署（us-epa）2001年頒布的《國(guó)家飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》（epa 816-f-09-004）中國(guó)家一級(jí)飲用水規(guī)程規(guī)定軍團(tuán)菌最大污染水平的控制目標(biāo)為零。世界衛(wèi)生組織（who）2011年發(fā)布的《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》第四版也已將軍團(tuán)菌列入12種水源性病原體之一，明確其衛(wèi)生學(xué)意義重大。

分離培養(yǎng)法是目前國(guó)際通用檢測(cè)軍團(tuán)菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，適用于各種環(huán)境水體。但也有研究者提出該方法存在操作繁瑣，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，易受雜菌干擾等缺陷。近些年出現(xiàn)了多種新的嗜肺軍團(tuán)菌定量檢測(cè)方法。其中，酶底物法作為一種同時(shí)適用于飲用水和非飲用水的嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)方法備受關(guān)注。北美、歐洲、日本等國(guó)家相繼對(duì)該方法進(jìn)行了能力驗(yàn)證及應(yīng)用，普遍認(rèn)為酶底物法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏性高的特點(diǎn)，可用于檢測(cè)飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌。目前，我國(guó)還未對(duì)該方法在檢測(cè)飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的可行性進(jìn)行研究?；诖?，本研究擬通過(guò)加標(biāo)試驗(yàn)對(duì)酶底物法檢測(cè)飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌最適宜的培養(yǎng)條件進(jìn)行探索，并運(yùn)用該方法對(duì)飲用水水樣進(jìn)行檢測(cè)分析，為進(jìn)一步探索適用于飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)所用的嗜肺軍團(tuán)菌質(zhì)控樣品nctc 11192（atcc 33152）購(gòu)置于美國(guó)愛(ài)德士生物科技公司（idexx），單只質(zhì)控樣真值為1 604±335 mpn/100ml。

1.2 儀器和試劑

程控定量封口機(jī)（idexx），恒溫培養(yǎng)箱，渦旋振蕩器，生物安全柜，離心機(jī)，水浴鍋，移液槍；酶底物培養(yǎng)基、定量盤(pán)（idexx），乳膠凝集試劑盒（oxoid），軍團(tuán)菌診斷血清試劑1-15型（天津生物芯片），bcye和bcye?cye培養(yǎng)基（陸橋），qiaamp dna mini kit試劑盒（qiagen）。

1.3 培養(yǎng)條件

1.3.1 方法原理

酶底物法是一種以細(xì)菌酶檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)，基于最可能數(shù)（most probable number, mpn）方法的定量檢測(cè)方法。嗜肺軍團(tuán)菌利用酶底物試劑中豐富的氨基酸、維生素和其他營(yíng)養(yǎng)成分迅速生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)會(huì)利用額外添加的酶底物反應(yīng)生成一種棕色的指示物使溶液顯褐色或者渾濁。

1.3.2 培養(yǎng)條件設(shè)置

本研究擬對(duì)培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行考察。根據(jù)分離培養(yǎng)法中軍團(tuán)菌最適培養(yǎng)溫度為36±1℃以及酶底物法中建議的飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌培養(yǎng)溫度為39℃，本研究將培養(yǎng)溫度設(shè)定為5組：33℃、36℃、39℃、42℃、45℃，每個(gè)溫度條件設(shè)9個(gè)平行樣，并在培養(yǎng)箱中放入一個(gè)裝有足量水的托盤(pán)，以保持培養(yǎng)箱中濕度適宜。培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為11 d，樣品在培養(yǎng)過(guò)程中每隔24h觀察記錄96孔定量盤(pán)的顏色和濁度變化，從第1 d到第11 d持續(xù)觀察。

1.3.3 培養(yǎng)方法

嗜肺軍團(tuán)菌質(zhì)控樣品用適量無(wú)菌去離子水稀釋，配制成高、中、低（321±67 mpn/100ml、64±13 mpn/100ml、8±2 mpn/100ml）三種不同濃度的100ml菌懸液作為陽(yáng)性待測(cè)樣品。在待測(cè)樣品中加入酶底物培養(yǎng)基，振蕩混勻并倒入96孔定量盤(pán)中，輕拍定量盤(pán)排出空氣后放入程控定量封口機(jī)中封口，最后將定量盤(pán)紙片一面朝下，在33℃、36℃、39℃、42℃、45℃溫度條件下培養(yǎng)。同時(shí)，用無(wú)菌水代替陽(yáng)性待測(cè)樣品，其他操作步驟同上述一致，設(shè)為陰性對(duì)照。

1.3.4 結(jié)果判讀

相對(duì)陰性對(duì)照而言，無(wú)論渾濁與否，任何顯褐色的跡象均認(rèn)為嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性；相對(duì)陰性對(duì)照而言，無(wú)論是否顯褐色，濁度大于陰性對(duì)照即認(rèn)為嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性；如顏色與濁度方面與陰性對(duì)照無(wú)差異，認(rèn)為嗜肺軍團(tuán)菌陰性。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果，數(shù)出顯陽(yáng)性的大小孔格數(shù)，對(duì)照mpn表得到嗜肺軍團(tuán)菌濃度（mpn/100ml）。

1.4 飲用水水樣檢測(cè)

1.4.1 水樣的采集和檢測(cè)

（1）采集水樣：于2020年6月隨機(jī)無(wú)菌采集北方某城市飲用水水樣，每份樣品100ml。水樣低溫運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室后室溫儲(chǔ)存，3 d內(nèi)進(jìn)行酶底物法檢測(cè)。

（2）培養(yǎng)方法：用水硬度測(cè)試條測(cè)定水樣的硬度。根據(jù)水的硬度進(jìn)行預(yù)處理：0~2個(gè)顯色條呈陽(yáng)性為低硬度，需向100ml水樣中加入酶底物補(bǔ)充劑0.33ml，3~4個(gè)顯色條呈陽(yáng)性為高硬度，需向100ml水樣中加入酶底物補(bǔ)充劑1ml。加入酶底物培養(yǎng)基到混合液中，振蕩混勻，倒盤(pán)封口。按照條件探索試驗(yàn)確定的最適培養(yǎng)條件培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。結(jié)果判讀同1.3.4。

1.4.2 陽(yáng)性孔確證試驗(yàn)

本研究同時(shí)采用血清凝集和16s rdna測(cè)序兩種方法對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。

（1）血清凝集法：用接種環(huán)取10 μl陽(yáng)性菌懸液涂布于bcye和bcye-cye培養(yǎng)基上，在co2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)2~4 d。對(duì)在bcye上生長(zhǎng)、bcye-cye上無(wú)生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行血清凝集型別鑒定，可分出血清1-15型。

（2）16s rdna序列分析：dna提取步驟按照qiaamp dna mini kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；16s rdna引物信息：引物f為5′-gttaagtcccgcaacga-3′；引物r為5′-ccaacagctagttgacatcg-3′，由某基因科技有限公司合成。pcr體系：1 μl模板，15 μl super mix，1 μl primer f（10p），1 μl primer r（10p），12 μl ddh2o，共30 μl。反應(yīng)程序：96℃預(yù)變形5min；96℃變性20s，62℃退火20s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸10min。擴(kuò)增后取3 μl pcr產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)并觀察條帶性狀；pcr產(chǎn)物純化按照磁珠純化標(biāo)準(zhǔn)操作流程操作；純化后的pcr產(chǎn)物由某基因科技有限公司進(jìn)行16s rdna測(cè)序分析。

1.5 質(zhì)量控制

atcc 33152為本次研究陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)控菌株。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用spss19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。嗜肺軍團(tuán)菌加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)溫度

加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)溫度為33℃時(shí)，嗜肺軍團(tuán)菌加標(biāo)回收率在21.3%~75%；當(dāng)培養(yǎng)溫度為36℃時(shí)，嗜肺軍團(tuán)菌最大檢出濃度接近加標(biāo)濃度，加標(biāo)回收率在89.5%~105%；當(dāng)培養(yǎng)溫度為39℃時(shí)，嗜肺軍團(tuán)菌最大檢出濃度與加標(biāo)濃度基本一致，加標(biāo)回收率在98.4%~108.8%；當(dāng)培養(yǎng)溫度為42℃時(shí)，嗜肺軍團(tuán)菌最大檢出濃度偏低，加標(biāo)回收率在25.8%~51.4%；當(dāng)培養(yǎng)溫度為45℃時(shí)，嗜肺軍團(tuán)菌最大檢出濃度明顯偏低，加標(biāo)回收率<34.6%。采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示f=17.90，p<0.05，認(rèn)為5組數(shù)據(jù)有顯著性差異，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。單因素方差分析兩兩比較結(jié)果顯示，39℃組與36℃組數(shù)據(jù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p=0.576）。

表1 不同培養(yǎng)溫度嗜肺軍團(tuán)菌最大檢出濃度（mpn/100ml）和加標(biāo)回收率（%）

注:經(jīng)單因素方差分析，p<0.05;

2.1.2 培養(yǎng)時(shí)間

由圖1a可知，嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性樣品在高濃度時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為45℃、42 ℃、39 ℃、36 ℃時(shí)，第4 d開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性現(xiàn)象，45℃、42 ℃、39 ℃ 時(shí)第7 d結(jié)果趨于穩(wěn)定，36 ℃條件下第8 d結(jié)果趨于穩(wěn)定；當(dāng)培養(yǎng)溫度為33℃時(shí)，第6 d開(kāi)始觀察到陽(yáng)性現(xiàn)象，直到第11 d未觀察到連續(xù)穩(wěn)定結(jié)果即未達(dá)到最大檢出濃度。由圖1b可知，嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性樣品在中濃度，培養(yǎng)溫度為42 ℃、39℃、36 ℃時(shí)，第4 d開(kāi)始觀察到陽(yáng)性現(xiàn)象，并分別在第6 d、第7 d、第9 d結(jié)果趨于穩(wěn)定；當(dāng)培養(yǎng)溫度為45℃、33℃時(shí)，第5 d開(kāi)始觀察到陽(yáng)性現(xiàn)象，并分別在第6 d和第10 d結(jié)果趨于穩(wěn)定。由圖1c可知，嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性樣品在低濃度，培養(yǎng)溫度為45℃ 時(shí)，未觀察到陽(yáng)性現(xiàn)象，分析可能是溫度過(guò)高導(dǎo)致嗜肺軍團(tuán)菌死亡或者活性消失；當(dāng)培養(yǎng)溫度為42℃時(shí)，在第5 d出現(xiàn)陽(yáng)性現(xiàn)象，第6 d結(jié)果趨于穩(wěn)定；當(dāng)培養(yǎng)溫度為39℃、36℃時(shí)，第4 d開(kāi)始觀察到陽(yáng)性現(xiàn)象，分別在第6 d和第9 d結(jié)果趨于穩(wěn)定；當(dāng)培養(yǎng)溫度為33℃時(shí)，在第6 d觀察到陽(yáng)性現(xiàn)象，第10 d結(jié)果趨于穩(wěn)定。

圖1 不同濃度嗜肺軍團(tuán)菌隨時(shí)間變化生長(zhǎng)曲線

2.2 飲用水水樣檢測(cè)

本研究采用酶底物法對(duì)采集的飲用水水樣進(jìn)行了嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)，共檢出嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性樣品4份，分離獲得4株嗜肺軍團(tuán)菌，通過(guò)乳膠凝集血清學(xué)分型分別為1型、15型、7型、10型嗜肺軍團(tuán)菌；另外通過(guò)16s rdna測(cè)序分析對(duì)其進(jìn)行菌株確證，結(jié)果顯示，分離的4株菌均屬嗜肺軍團(tuán)菌，表現(xiàn)為2種基因型，命名為lp-no.1和lp-no.2。其中l(wèi)p-no.1有2株，對(duì)應(yīng)的血清型為1型和7型；lp-no.2有2株，對(duì)應(yīng)的血清型為10型和15型。根據(jù)blast結(jié)果顯示，lp-no.1株與cp048618.1 legionella pneumophila親緣關(guān)系最近，相似性為100%；lp-no.2與lr134380.1 legionella pneumophila subsp. pascullei親緣關(guān)系最近，相似性為99?77%?，F(xiàn)基于16s rdna測(cè)序結(jié)果建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示。

圖2 基于16s rdna測(cè)序結(jié)果的嗜肺軍團(tuán)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

培養(yǎng)溫度是影響嗜肺軍團(tuán)菌生長(zhǎng)繁殖的重要因素，一般認(rèn)為軍團(tuán)菌可在20~50℃的水溫環(huán)境下生存，最佳生存溫度為25~42 ℃。研究表明，當(dāng)酶底物法培養(yǎng)溫度高至42℃以上或低至33℃以下時(shí)，嗜肺軍團(tuán)菌最大檢出濃度均明顯低于理論濃度的50%，即加標(biāo)回收率均低于50%，說(shuō)明高溫可以殺滅嗜肺軍團(tuán)菌或使其活性喪失，而溫度過(guò)低又會(huì)導(dǎo)致嗜肺軍團(tuán)菌活性降低，使顯色反應(yīng)延遲或不發(fā)生。本研究中，當(dāng)培養(yǎng)溫度為39℃和36℃時(shí)，嗜肺軍團(tuán)菌最大檢出濃度值與理論濃度值基本一致，即均可達(dá)到較高的加標(biāo)回收率，為較適宜的培養(yǎng)溫度，且從圖2的指數(shù)增長(zhǎng)曲線可以看出39℃時(shí)嗜肺軍團(tuán)菌最大檢出濃度比36℃時(shí)更接近理論濃度值，但未發(fā)現(xiàn)兩者存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶底物法具有顯著的影響。相同溫度條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，嗜肺軍團(tuán)菌檢出率增高。當(dāng)溫度≥39℃時(shí)指數(shù)增長(zhǎng)階段集中在第4~7 d，當(dāng)溫度＜39℃時(shí)指數(shù)增長(zhǎng)階段集中在第4~10 d。結(jié)合培養(yǎng)溫度的研究結(jié)果，重點(diǎn)比較39℃和36℃培養(yǎng)溫度下嗜肺軍團(tuán)菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)。結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)溫度為39℃時(shí)，高中低濃度陽(yáng)性樣品均能穩(wěn)定在第4 d開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性顯色現(xiàn)象，并在第6 d或第7 d達(dá)到最大檢出濃度；當(dāng)培養(yǎng)溫度為36℃時(shí)，高中低濃度陽(yáng)性樣品均在第4 d開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性顯色現(xiàn)象，并在第8 d或第9 d達(dá)到最大檢出濃度。綜合考慮培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間，在保證高回收率的同時(shí)盡可能縮短培養(yǎng)周期，本研究認(rèn)為酶底物法在39℃條件下，選擇7 d作為培養(yǎng)時(shí)間，嗜肺軍團(tuán)菌的檢出效果最好。

3.2 方法的特異性

本研究通過(guò)酶底物法對(duì)北方某城市的部分飲用水水樣進(jìn)行檢測(cè)，共檢出嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性4份，通過(guò)血清分型試驗(yàn)和16s rdna序列分析對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證，兩種確證方法結(jié)果一致，4份陽(yáng)性樣品均為嗜肺軍團(tuán)菌。結(jié)果表明，本研究通過(guò)酶底物法檢測(cè)獲得的4份嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性水樣特異性為100%，這與spies k等人的研究結(jié)果相同。