tembusu病毒（tmuv）是一大群單正鏈，有包膜。rna病毒。這種病毒通過吸血的節(jié)肢動物(蚊子、蜱蟲、白飛等)傳播而引起感染。在中國，tembusu病毒（tmuv）爆發(fā)和傳播給我國水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失。本文由江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所趙冬敏博士發(fā)表frontiers in microbiology雜志發(fā)表題目identification of glucose-regulated protein 78 (grp78) as a receptor in bhk-21 cells for duck tembusu virus infection該研究報告了研究論文bhk-21細(xì)胞中tmuv結(jié)合分子探究。

研究背景

自2010年以來，tembusu病毒（tmuv）嚴(yán)重的鴨病在我國許多省份引起并迅速傳播。tembusu病毒屬于黃病毒，由三種結(jié)構(gòu)蛋白(包膜[e]，衣殼[c]和膜[m]）它由七種非結(jié)構(gòu)蛋白組成。黃色病毒e蛋白質(zhì)主要作為受體結(jié)合蛋白，是毒性、細(xì)胞向性和宿主范圍的主要決定因素。黃病毒感染作為包膜病毒的第一步涉及e蛋白質(zhì)與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合。黃色病毒可以識別單個細(xì)胞的表面分子或使用多個受體進(jìn)入細(xì)胞。然后，黃色病毒通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的吞咽進(jìn)入細(xì)胞并傳遞給內(nèi)體。內(nèi)體的酸性條件觸發(fā)e蛋白質(zhì)介導(dǎo)病毒與內(nèi)膜的膜融合。最后，形成一個融合孔，將核衣殼釋放到細(xì)胞溶膠中。近年來，鑒定了多種組合因素，表明黃病毒可以利用多種受體進(jìn)入細(xì)胞，這是菌株特異性和/或細(xì)胞類型依賴性。bhk-21細(xì)胞中tmuv結(jié)合分子還不清楚。

實驗方法

1. ip lc-ms/ms病毒與受體結(jié)合鑒定

2.?western blot以及免疫熒光檢測受體的表達(dá)

3.過表達(dá)功能實驗

結(jié)果分析

1.鑒定grp78是tmuv膜蛋白結(jié)合

使用病毒覆蓋蛋白結(jié)合測定參與初步鑒定tmuv結(jié)合的bhk-21細(xì)胞中的分子。70kda獨特的病毒組合條帶。tmuv時，tmuv特異性結(jié)合帶不能單抗檢測(圖)1a）。通過質(zhì)譜鑒定，在70kda九種蛋白質(zhì)是在條帶中確定的。八種蛋白質(zhì)參與細(xì)胞代謝和骨架。grp78已被認(rèn)定為日本腦炎病毒denv作者決定對受體進(jìn)行研究grp78是否在tmuv與細(xì)胞結(jié)合起作用。如圖1所示，抗性grp78抗體可以特異性識別70kda蛋白質(zhì)條帶進(jìn)一步證實tmuv和grp78相互作用。

圖1 |鑒定grp78是tmuv膜蛋白結(jié)合

2.grp78抗體競爭性抑制tmuv進(jìn)入

bhk-21細(xì)胞與針對grp78的n-或c-抗體在末端結(jié)構(gòu)區(qū)預(yù)孵化，然后進(jìn)行tmuv感染。在n-末端grp78病毒rna水平顯著低于非特異性兔igg細(xì)胞的處理，表明n末端grp78抗體可以顯著減少病毒的結(jié)合。c末端grp78抗體不會影響病毒結(jié)合(圖2)。

圖2 |抗grp78抗體抑制bhk-21細(xì)胞中的tmuv感染

3.?grp78在bhk-21細(xì)胞表面表達(dá)與和諧tmuv共定位

傳統(tǒng)上，grp78被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白質(zhì)。最近的研究表明，grp78也表達(dá)在細(xì)胞表面。grp78在bhk-21細(xì)胞表面的表達(dá)來自于分離bhk-21細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞蛋白，并分析蛋白質(zhì)痕跡。western blot結(jié)果顯示grp78可在bhk-21細(xì)胞表面表達(dá)(圖3a）。然后觀察作者間接免疫熒光測定法grp78和tmuv在bhk-21細(xì)胞中的共定位。結(jié)果顯示grp78與bhk-21細(xì)胞表面tmuv共定位（圖3b）。

圖3 | grp78和tmuv在bhk-21共定位細(xì)胞表面

4.bhk-21細(xì)胞中g(shù)rp78的rna干擾抑制tmuv感染

進(jìn)一步證明grp78在tmuv通過結(jié)合和進(jìn)入細(xì)胞的作用shrna降低grp78蛋白在bhk21細(xì)胞中的豐度。qrt-pcr表明在bhk-21細(xì)胞中g(shù)rp78的mrna顯著抑制水平(圖4a）。純化細(xì)胞表面蛋白，分析蛋白質(zhì)痕跡，顯示表面grp78蛋白質(zhì)豐度降低約70%4b）。與空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，grp78 shrna其轉(zhuǎn)染細(xì)胞tmuv rna水平顯著降低(約60%)4c）。結(jié)果表明grp78在tmuv結(jié)合和進(jìn)入bhk-21在細(xì)胞過程中起著重要作用。

圖4 |grp78 shrna感染48小時后對tmuv進(jìn)入的影響

5.bhk-21在細(xì)胞中表達(dá)grp78會提高tmuv感染

然后作者發(fā)現(xiàn)了表達(dá)grp78在細(xì)胞中，它tmuv rna水平顯著提高(圖5)。通過敲低和表達(dá)功能實驗證明grp78蛋白支持tmuv進(jìn)入bhk-21細(xì)胞。

圖5?|grp78表達(dá)48小時后對tmuv進(jìn)入的影響

實驗結(jié)論

本文首次鑒定grp78是bhk-21細(xì)胞感染tmuv時的受體。grp78參與tmuv結(jié)合并進(jìn)入受體bhk-21細(xì)胞在病毒感染中起著重要作用。grp78可以更好更好的了解tmuv發(fā)病機(jī)制。grp78對tmuv感染的多重關(guān)鍵作用可能為抗病毒藥物的設(shè)計提供新的目標(biāo)和相關(guān)的目標(biāo)tmuv其他預(yù)防和控制的信息。

tembusu病毒（tmuv）爆發(fā)和傳播給我國水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失。在本文的研究中，作者利用蛋白質(zhì)組的學(xué)質(zhì)譜鑒定技術(shù)來確定grp78蛋白是鴨tmuv感染的bhk-21細(xì)胞中的受體。這篇文章首先來自bhk-21細(xì)胞膜通過病毒覆蓋蛋白結(jié)合試驗（vopba）觀察到約70kda的tmuv結(jié)合蛋白質(zhì)。免疫共沉淀結(jié)合lc-ms/ms鑒定grp78為與tmuv相互作用的蛋白質(zhì)。grp78抗體可抑制tmuv與bhk-21細(xì)胞表面的組合。間接免疫熒光顯示grp78與tmuv在細(xì)胞表面共定位。此外，功能實驗表明降低/過表達(dá)grp78抑制/增加tmuv感染。這些結(jié)果表明grp78是參與tmuv新宿主因素。本文通過蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)鑒定病毒與受體相結(jié)合的思路值得借鑒。上海鹿明生物科技有限公司協(xié)助完成蛋白質(zhì)鑒定。

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